近日，精密測量院楊俊研究團隊在天然細胞膜固體核磁共振（NMR）結構測定方面取得系列進展，相關研究成果發表在國際期刊《科學-進展》（Science Advances）和《美國化學會志-金》（JACS Au）上。

研究團隊在膜蛋白細胞膜樣品制備和原位結構測定方面取得進展

膜蛋白在高度異質和復雜的細胞膜環境中行使功能。細胞膜的組成以及物理化學性質對膜蛋白的結構和功能有重要的影響，因此準確地闡明膜蛋白在天然細胞膜環境中的結構對于理解其真實的功能機制至關重要。但是在天然細胞膜中測定膜蛋白的結構面臨著諸多挑戰，這主要是因為天然細胞膜系統的高度不均勻性、復雜的背景信號干擾以及目標蛋白的低豐度限制了常用結構分析技術的檢測分辨率和靈敏度。因此迄今為止，蛋白質數據庫中幾乎所有可用的膜蛋白結構均是在體外簡化的膜模擬物（如去垢劑膠束、 納米盤和合成磷脂膜等）中得到（圖2）。然而，這些膜模擬環境均很難模擬出天然細胞膜獨特的理化特性，如細胞膜的疏水厚度、側壓、化學梯度、電場梯度等，這些理化特性的差異可能會對膜蛋白的結構和功能產生影響。此外，在這些樣品制備過程中需要將膜蛋白從其原生的細胞膜環境中提取出來，再重組到膜模擬環境中，這可能會導致蛋白質的結構改變或活性喪失。因此，在天然的細胞膜環境中測定膜蛋白結構是一個非常重要但極具挑戰性的課題。

不同膜模擬環境

固體NMR在膜蛋白原位結構測定方面具有獨特的優勢，但同樣也面臨著背景信號干擾嚴重、目標信號信噪比弱、難以獲得足夠數量距離約束等嚴峻挑戰。雖然前人已經進行了諸多嘗試，但迄今為止，還未能成功在天然細胞膜中測定膜蛋白高分辨率三維結構。為了克服這些困難，楊俊研究團隊提出了一種新的固體NMR結構測定方法，該方法包括改進的細胞膜樣品制備方案、先進的固體NMR技術和結構模型輔助的歸屬策略，成功在天然細胞膜中實現了膜蛋白三維結構的測定。

背景蛋白信號的干擾一直是利用固體NMR測定天然細胞膜中膜蛋白三維結構的一個主要障礙。研究團隊結合各種抑制背景蛋白表達和標記的技術，包括優化蛋白表達條件、菌株篩選、“雙培養基”以及內外膜分離等，提出了一種改進的樣品制備方案（圖3）。該方案可以實現背景蛋白信號的完全抑制，同時保持目標蛋白的高靈敏度。

改進的細胞膜樣品制備方案

基于所建立的天然細胞膜樣品制備方案，研究團隊在天然細胞膜中成功表征了機械敏感性通道蛋白MscL的二級結構，并證明了獲取其長程距離約束的可行性。這一突破為進一步在天然細胞膜中測定膜蛋白的三維結構奠定了基礎。

為了獲得足夠數量的距離約束，研究團隊采用先進的固體NMR技術，包括多種¹³C-¹³C偶極重耦方法（圖4A），而后引入了結構模型輔助的歸屬策略，通過利用單體和四聚體結構模型來減少距離約束的模糊性（圖4B)， 最終獲得了1000多個距離約束。

高質量歸屬和距離約束譜圖和結構模型輔助的歸屬策略

基于上述結構測定方法，研究團隊成功地在天然細胞膜中測定了水通道蛋白AqpZ的結構，其骨架均方根偏差（RMSD）為1.7 0.4 ？。這是國際上首次利用固體NMR在天然細胞膜中實現膜蛋白高分辨率三維結構的測定。這項研究證明了固體NMR在天然細胞膜環境中測定膜蛋白高分辨率三維結構的可行性和巨大潛力，對于結構生物學領域具有重要意義。

結構測定方法以“Solid-state NMR structure determination of a membrane protein in E. coli cellular inner membrane”為題發表在國際期刊《科學-進展》（Science Advances）上，精密測量院博士后謝華勇、趙永祥為第一作者，楊俊為通訊作者。細胞膜樣品制備方法以“Membrane Protein Structures in Native Cellular Membranes Revealed by Solid-state NMR Spectroscopy”為題發表在《美國化學會志-金》（JACS Au）上，精密測量院博士后張艷、博士生甘悅芳、實驗師趙偉靜為第一作者，謝華勇、楊俊為通訊作者。精密測量院為以上研究工作的第一完成單位，以上研究工作得到了科技部重點研發計劃和國家自然科學基金的資助。

論文鏈接：

Science Advances : https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.adh4168

JACS Au : https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacsau.3c00564